bioselБиотехнология и селекция растенийPlant Biotechnology and Breeding2658-62662658-6258VIR10.30901/2658-6266-2025-2-o4biosel-272Research ArticleМЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВЕ РАСТЕНИЙBIOTECHNOLOGY TECHNIQUES IN PLANT BREEDING AND SEED PRODUCTIONПротокол получения трансформантов вигны Vigna unguiculata (L.) Walp. – носителей редактирующих конструкцийProtocol for obtaining Vigna unguiculata (L.) Walp. transformants carrying editing constructshttps://orcid.org/0000-0002-4917-6862КрыловаЕ. А.KrylovaE. A.

Екатерина Александровна Крылова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44

Ekaterina A. Krylova, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, VIR

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

e.krylova@vir.nw.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9212-2117ЕфремоваО. С.EfremovaO. S.

Ольга Сергеевна Ефремова, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий специалист, ВИР; Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни

190000 Россия, Санкт- Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44; 354340 Россия, Краснодарский край, федеральная территория «Сириус», пгт. Сириус, Олимпийский пр., 1

Olga S. Efremova, Cand. Sci. (Agriculture), Researcher, VIR; Sirius University 

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia; 1, Olympic avenue, Sirius urbantype settlement, Sirius Federal Territory, Krasnodar region, 354340 Russia

efremo.olga2010@yandex.ruВилисП. С.VilisP. S.

Полина Сергеевна Вилис, лаборант-исследователь, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44

Polina S. Vilis, Laboratory Researcher, VIR

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia

p.vilis@vir.nw.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8470-8254ХлесткинаЕ. К.KhlestkinaE. K.

Елена Константиновна Хлесткина, доктор биологических наук, профессор РАН, директор, ВИР

190000 Россия, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44

Elena K. Khlestkina, Dr. Sci. (Biology), Professor of the Russian Academy of Sciences (RAS), Director, VIR

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg, 190000 Russia

director@vir.nw.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9366-0216УхатоваЮ. В.UkhatovaYu. V.

Юлия Васильевна Ухатова, кандидат биологических наук, заместитель директора, ВИР; Научно-технологический университет «Сириус», Научный центр генетики и наук о жизни

190000 Россия, Санкт- Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44; 354340 Россия, Краснодарский край, федеральная территория «Сириус», пгт. Сириус, Олимпийский пр., 1

 

Yulia V. Ukhatova, Cand. Sci. (Biology), Deputy Director, VIR; Sirius University 1, Olympic avenue, Sirius urbantype settlement, Sirius Federal Territory, Krasnodar region, 354340 Russia

42, 44 Bolshaya Morskaya Street, St. Petersburg 190000, Russia; 1, Olympic avenue, Sirius urbantype settlement, Sirius Federal Territory, Krasnodar region, 354340 Russia

 

y.ukhatova@vir.nw.ruФедеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. ВавиловаN.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic ResourcesФедеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова; Научно-технологический университет «Сириус»N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources; Sirius University of Science and Technology20251311202582715Copyright © Крылова Е.А., Ефремова О.С., Вилис П.С., Хлесткина Е.К., Ухатова Ю.В., 20252025Крылова Е.А., Ефремова О.С., Вилис П.С., Хлесткина Е.К., Ухатова Ю.В.Krylova E.A., Efremova O.S., Vilis P.S., Khlestkina E.K., Ukhatova Y.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://biosel.elpub.ru/jour/article/view/272

Актуальность. Для трансформации клеток высших растений чаще всего используют метод агробактериальной трансформации, при этом важное значение имеет выбор экспланта, состав питательных сред для отбора и регенерации трансформантов. Вигна Vigna unguiculata (L.) Walp., представитель семейства Бобовых, относится к культурам, сложно поддающимся трансформации в связи с низким регенерационным потенциалом после инокуляции агробактерией. Поиск генотипов, отличающихся высокой степенью регенерации, а также составление эффективного протокола агробактериальной трансформации являются актуальной задачей для доставки компонентов системы редактирования. Цель настоящего исследования – разработать эффективный протокол получения трансформантов вигны – носителей редактирующих конструкций. Материалы и методы. Разработку эффективного протокола получения трансформантов вигны для доставки компонентов системы редактирования осуществляли при использовании образцов коллекции ВИР. В качестве эксплантов использовали части семядольного узла. Для увеличения площади раневой поверхности эксплант формировали путем продольного разреза семядольного узла. Агробактериальную трансформацию проводили при использовании генетической конструкции, созданной на основе вектора pKSE401 с компонентами системы редактирования CRISPR/Cas9. Индукцию органогенеза осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 6-бензиламинопурина. В статье описан пошаговый протокол для эффективного получения фертильных трансформантов вигны. Результаты и обсуждение. Мы экспериментально подтвердили способность части семядольного узла вигны к органогенезу побегов в культуре in vitro, а также возможность использования их в качестве эксплантов для агробактериальной трансформации с достижением частоты фертильных трансформантов на уровне 6,2% для генотипа к-642. Сравнение эффективности трансформации с данными предшествующих работ по агробактериальной трансформации вигны указывает на лучший выход трансформантов на основе предложенного нами протокола. Поскольку протокол валидирован в эксперименте с вектором, несущим компоненты системы редактирования CRISPR/Cas9, его можно рекомендовать для использования в работах по получению редактированных растений вигны. Заключение. Полученные результаты агробактериальной трансформации модифицированного типа эксплантов вигны свидетельствуют о возможности успешного использования представленного протокола для генетической трансформации данной культуры. Генотип к-642, показавший эффективность не только на этапах регенерации и трансформации, но также на стадиях укоренения и последующей адаптации растений к нестерильным условиям, может быть рекомендован для дальнейших фундаментальных исследований вигны при помощи методов обратной генетики.

Background. The method of agrobacterium mediated transformation is most often used for the transformation of higher plant cells. The choice of explant type, the composition of nutrient media for the selection and regeneration of transformants are important. Cowpea Vigna unguiculata (L.) Walp. is a legume crop. It is recalcitrant for transformation due to its low regeneration after agrobacterial inoculation. The search for genotypes with a high regeneration ability, as well as the creation of an effective protocol for optimal Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection protocol are urgent tasks for the delivery of editing system components. The aim of this study is to develop an effective protocol for obtaining cowpea transformants carrying editing constructs. Material and methods. The development of the efficient protocol for obtaining cowpea transformants for the delivery of editing system components was carried out using accessions from the VIR collection. Cotyledonary node parts were used as explants formed by longitudinal incision of the cotyledon node in order to increase the wound surface area. The agrobacterium mediated transformation was performed using a vector on the base of pKSE401 with components of the CRISPR/Cas9 editing system. Organogenesis was induced on MS nutrient medium with phytohormones. The article describes a step-by-step protocol for the efficient production of fertile cowpea transformants. Results and discussion. We experimentally confirmed the organogenetic capacity of the cowpea cotyledonary node to produce shoots in vitro, as well as the possibility of using them as explants for agrobacterium mediated transformation. The frequency of fertile transformants was 6.2% for k-642 genotype. A comparison of the transformation efficiency with the data from previous studies on the cowpea agrobacterium mediated transformation indicates a better yield of transformants based on our proposed protocol. Since the protocol has been validated in the experiment with a vector carrying components of the CRISPR/Cas9 editing system, it can be recommended for use in studies on the production of edited cowpea plants. Conclusion. The obtained results of the agrobacterium mediated transformation of cowpea modified type explants indicate the possibility of successful use of the presented protocol for the genetic transformation of this crop. The k-642 genotype was efficient not only at the stages of regeneration and transformation, but also at the stages of rooting and subsequent plant adaptation to non-sterile conditions. This genotype can be recommended for further fundamental cowpea studies using reverse genetics methods.

вигнаагробактериальная трансформациярегенерация in vitroрегенерантыредактированиеcowpeaagrobacterium mediated transformationin vitro regenerationregenerantseditingРабота выполнена при поддержке Российского научного фонда – проект №21-66-00012.this research was supported by the Russian Science Foundation under Project No. 21-66-00012.ReferencesBehura R., Kumar S., Saha B., Panda M.K., Dey M., Sadhukhan A., Mishra S., Alam S., Sahoo D.P., Sugla T., Sahoo L. Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.]. In: Methods in Molecular Biology. Vol. 1223. K. Wang (ed.) Agrobacterium Protocols. Vol. 1, Ch. 20. New York, NY: Springer Humana Press; 2014. p.255-264. DOI: 10.1007/978-1-4939-1695-5_20Behura R., Kumar S., Saha B., Panda M.K., Dey M., Sadhukhan A., Mishra S., Alam S., Sahoo D.P., Sugla T., Sahoo L. Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.]. In: Methods in Molecular Biology. Vol. 1223. K. Wang (ed.) Agrobacterium Protocols. Vol. 1, Ch. 20. New York, NY: Springer Humana Press; 2014. p.255-264. DOI: 10.1007/978-1-4939-1695-5_20Bett B., Gollasch S., Moore A., Harding R., Higgins T.J.V. An improved transformation system for cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) via sonication and a kanamycin-geneticin selection regime. Frontiers in Plant Science. 2019;10:219. DOI: 10.3389/fpls.2019.00219Bett B., Gollasch S., Moore A., Harding R., Higgins T.J.V. An improved transformation system for cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) via sonication and a kanamycin-geneticin selection regime. Frontiers in Plant Science. 2019;10:219. DOI: 10.3389/fpls.2019.00219Бурляева М.О., Гуркина М.В., Чебукин П.А. Скрининг образцов спаржевой вигны (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis (L.) Verdc.) из коллекции ВИР на устойчивость к абиотическим и биотическим стрессорам. Селекция и семеноводство овощных культур. 2014;45:131-141.Burlyaeva M.O., Gurkina M.V., Chebukin P.A Screening of long-podded cowpea (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis (L.) Verdc.) samples from VIR collection for resistance to biotic and abiotic stressors (Skrining obraztsov sparzhevoy vigny (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis (L.) Verdc.) iz kollektsii VIR na ustoychivost' k abioticheskim i bioticheskim stressoram). Breeding and seed production of vegetable crops = Selektsiya i semenovodstvo ovoshchnykh kul’tur. 2014;45:131-141. [In Russian]Che P., Chang S., Simon M.K., Zhang Z., Shaharyar A., Ourada J., O’Neill D., Zhang Z., Torres-Mendoza M., Guo Y., Marasigan K.M, Vielle-Calzada J.-P., Ozias-Akins P., Albertsen M.C., Jones T.J. Developing a rapid and highly efficient cowpea regeneration, transformation and genome editing system using embryonic axis explants. The Plant Journal. 2021;106(3):817-830. DOI: 10.1111/tpj.15202Che P., Chang S., Simon M.K., Zhang Z., Shaharyar A., Ourada J., O’Neill D., Zhang Z., Torres-Mendoza M., Guo Y., Marasigan K.M, Vielle-Calzada J.-P., Ozias-Akins P., Albertsen M.C., Jones T.J. Developing a rapid and highly efficient cowpea regeneration, transformation and genome editing system using embryonic axis explants. The Plant Journal. 2021;106(3):817-830. DOI: 10.1111/tpj.15202Ефремова О.С., Шкрыль Ю.Н., Веремейчик Г.Н. Регенерационный потенциал in vitro сортов сои (Glycine max (L.) Merr.) при агробактериальной трансформации. Аграрный вестник Приморья. 2017;4(8):21-23.Efremova O.S., Shkryl Y.N., Veremeichik G.N. Regeneration potential in vitro of soybean varieties in agrobacterial transformation. Agrarian bulletin of Primorye. 2017;4(8):21-23. [in Russian]Gerasimova S.V., Kolosovskaya E.V., Vikhorev A.V., Korotkova A.M., Hertig C.W., Genaev M.A., Domrachev D.V., Morozov S.V., Chernyak E.I., Shmakov N.A., Vasiliev G.V., Kochetov A.V., Kumlehn J., Khlestkina E.K. WAX INDUCER 1 Regulates β-Diketone Biosynthesis by Mediating Expression of the Cer-cqu gene cluster in barley. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24:6762. DOI: 10.3390/ijms24076762Gerasimova S.V., Kolosovskaya E.V., Vikhorev A.V., Korotkova A.M., Hertig C.W., Genaev M.A., Domrachev D.V., Morozov S.V., Chernyak E.I., Shmakov N.A., Vasiliev G.V., Kochetov A.V., Kumlehn J., Khlestkina E.K. WAX INDUCER 1 Regulates β-Diketone Biosynthesis by Mediating Expression of the Cer-cqu gene cluster in barley. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24:6762. DOI: 10.3390/ijms24076762Ignacimuthu S. Agrobacterium mediated transformation of Vigna sesquipedalis Koern (asparagus bean). Indian journal of experimental biology. 2000;38(5):493–498.Ignacimuthu S. Agrobacterium mediated transformation of Vigna sesquipedalis Koern (asparagus bean). Indian journal of experimental biology. 2000;38(5):493–498.Integrated DNA Technologies. PrimerQuest™ Tool. Available from: https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest [accessed Febr. 01, 2024].Integrated DNA Technologies. PrimerQuest™ Tool. Available from: https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest [accessed Febr. 01, 2024].Ji J., Zhang C., Sun Z., Wang L., Duanmu D., Fan Q. Genome editing in cowpea Vigna unguiculata using CRISPR-Cas9. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20(10):2471. DOI: 10.3390/ijms20102471Ji J., Zhang C., Sun Z., Wang L., Duanmu D., Fan Q. Genome editing in cowpea Vigna unguiculata using CRISPR-Cas9. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20(10):2471. DOI: 10.3390/ijms20102471Juranić M., Nagahatenna D.S.K., Salinas-Gamboa R., Hand M.L., Sánchez León N., Leong W.H., How T., Bazanova N., Spriggs A., Vielle Calzada J.-P., Koltunow A.M.G. A Detached leaf assay for testing transient gene expression and gene editing in cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.). Plant Methods. 2020;16:88. DOI: 10.1186/s13007-020-00630-4Juranić M., Nagahatenna D.S.K., Salinas-Gamboa R., Hand M.L., Sánchez León N., Leong W.H., How T., Bazanova N., Spriggs A., Vielle Calzada J.-P., Koltunow A.M.G. A Detached leaf assay for testing transient gene expression and gene editing in cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.). Plant Methods. 2020;16:88. DOI: 10.1186/s13007-020-00630-4Jyothishwaran G., Kotresha D., Selvaraj T., Srideshikan S.H., Rajvanshi P.K., Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science. 2007;93(6):770-772.Jyothishwaran G., Kotresha D., Selvaraj T., Srideshikan S.H., Rajvanshi P.K., Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science. 2007;93(6):770-772.Krylova E.A., Burlyaeva M.O., Tvorogova V.E., Khlestkina E.K. Contrast relative humidity response of diverse cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) genotypes: deep study using RNAseq approach. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25:11056. DOI: 10.3390/ijms252011056Krylova E.A., Burlyaeva M.O., Tvorogova V.E., Khlestkina E.K. Contrast relative humidity response of diverse cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) genotypes: deep study using RNAseq approach. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25:11056. DOI: 10.3390/ijms252011056Mao J.Q., Zaidi M.A., Arnason J.T., Altosaar I. In vitro regeneration of Vigna unguiculata (L.) Walp. cv. Blackeye cowpea via shoot organogenesis. Plant Cell Tissue Organ Culture. 2006;87:121-125. DOI: 10.1007/s11240-006-9145-8Mao J.Q., Zaidi M.A., Arnason J.T., Altosaar I. In vitro regeneration of Vigna unguiculata (L.) Walp. cv. Blackeye cowpea via shoot organogenesis. Plant Cell Tissue Organ Culture. 2006;87:121-125. DOI: 10.1007/s11240-006-9145-8Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15:473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xMurashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15:473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xMuthukumar B., Mariamma M., Veluthambi K., Gnanam A. Genetic transformation of cotyledon explants of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Report. 1996;15:980-985. DOI: 10.1007/BF00231600Muthukumar B., Mariamma M., Veluthambi K., Gnanam A. Genetic transformation of cotyledon explants of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Report. 1996;15:980-985. DOI: 10.1007/BF00231600Pal J.K., Kumar S., Singh M. Genetic transformation of Vigna unguiculata tissue by Agrobacterium tumifaciens. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2011;71(1):84-86.Pal J.K., Kumar S., Singh M. Genetic transformation of Vigna unguiculata tissue by Agrobacterium tumifaciens. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2011;71(1):84-86.Popelka J.C., Gollasch S., Moore A., Molvig L., Higgins T.J. Genetic transformation of cowpea (Vigna unguiculata L.) and stable transmission of the transgenes to progeny. Plant Cell Reports. 2006;25(4):304-312. DOI: 10.1007/s00299-005-0053-xPopelka J.C., Gollasch S., Moore A., Molvig L., Higgins T.J. Genetic transformation of cowpea (Vigna unguiculata L.) and stable transmission of the transgenes to progeny. Plant Cell Reports. 2006;25(4):304-312. DOI: 10.1007/s00299-005-0053-xPratap A., Prajapati U., Singh C.M., Gupta S., Rathore M., Malviya N., Tomar R., Gupta A.J., Tripathi S., Singh N.P. Potential, constraints and applications of in vitro methods in improving grain legumes. Plant Breeding. 2018;137:235-249. DOI: 10.1111/pbr.12590Pratap A., Prajapati U., Singh C.M., Gupta S., Rathore M., Malviya N., Tomar R., Gupta A.J., Tripathi S., Singh N.P. Potential, constraints and applications of in vitro methods in improving grain legumes. Plant Breeding. 2018;137:235-249. DOI: 10.1111/pbr.12590Razgonova M.P., Burlyaeva M.O., Zinchenko Y.N., Krylova E.A., Chunikhina O.A., Ivanova N.M., Zakharenko A.M., Golokhvast K.S. Identification and spatial distribution of bioactive compounds in seeds Vigna unguiculata (L.) Walp. by laser microscopy and tandem mass spectrometry. Plants. 2022;11:2147. DOI: 10.3390/ plants11162147Razgonova M.P., Burlyaeva M.O., Zinchenko Y.N., Krylova E.A., Chunikhina O.A., Ivanova N.M., Zakharenko A.M., Golokhvast K.S. Identification and spatial distribution of bioactive compounds in seeds Vigna unguiculata (L.) Walp. by laser microscopy and tandem mass spectrometry. Plants. 2022;11:2147. DOI: 10.3390/ plants11162147Sahoo L., Sugla T., Jaiwal P.K. In vitro regeneration and genetic transformation of cowpea, mungbean, urdbean and azuki bean In: P.K. Jaiwal; R.P. Singh (eds). Applied Genetics of Leguminosae Biotechnology. Dordrecht; Boston: Kluwer Academic Publishers; 2003. p.89-120.Sahoo L., Sugla T., Jaiwal P.K. In vitro regeneration and genetic transformation of cowpea, mungbean, urdbean and azuki bean In: P.K. Jaiwal; R.P. Singh (eds). Applied Genetics of Leguminosae Biotechnology. Dordrecht; Boston: Kluwer Academic Publishers; 2003. p.89-120.Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M. Recent advances in legume transformation. Plant Physiology. 2003;131:892-899. DOI: 10.1104/pp.102.017681Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M. Recent advances in legume transformation. Plant Physiology. 2003;131:892-899. DOI: 10.1104/pp.102.017681Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E.A., Mikhailova A.S., Semilet T.V., Tikhonova N.G., Shvachko N.A., Khlestkina E.K. Improvement of crops using the CRISPR/Cas System: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E.A., Mikhailova A.S., Semilet T.V., Tikhonova N.G., Shvachko N.A., Khlestkina E.K. Improvement of crops using the CRISPR/Cas System: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135Xing H.-L., Dong L., Wang Z.-P., Zhang H.-Y., Han C.-Y., Liu B., Wang X.-C., Chen Q.-J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 2014;14:327. DOI: 10.1186/s12870-014-0327-yXing H.-L., Dong L., Wang Z.-P., Zhang H.-Y., Han C.-Y., Liu B., Wang X.-C., Chen Q.-J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 2014;14:327. DOI: 10.1186/s12870-014-0327-y

The authors declare that there are no conflicts of interest present.