Протеолитическая деградация белков семян видов вики (Vicia L. subgenus Vicia) секции Peregrinae Kupicha при SDS-электрофорезе и её предотвращение

Актуальность. SDS-электрофорез белков семян благодаря своей простоте и хорошей воспроизводимости результатов широко используется при изучении генофонда бобовых и других растений, видовой и сортовой идентификации, анализе внутривидовой изменчивости, а также регистрации коллекционного материала. Данные, полученные этим методом, хорошо согласуются с результатами анализа ДНК или служат дополнением к ним. Как правило, белки семян бобовых, включая представителей рода Vicia L., подвергнутые SDS-электрофорезу, образуют чёткие информативные спектры. При анализе белков многих образцов семян видов вики секции Peregrinae Kupicha при использовании стандартных подходов, разработанных ранее в ВИР и одобренных ISTA (the International Seed Testing Association), не удалось получить чёткие электрофоретические спектры. Это поставило под вопрос применимость стандартных подходов к идентификации видов вики из секции Peregrinae. Задача работы – выяснение причин деградации белков семян у представителей секции Peregrinae и нахождение путей её предотвращения для обеспечения возможности проведения видовой идентификации и регистрации образцов коллекции вики с использованием единого подхода. Материалы и методы. Белки семян ряда видов вики Vicia L. subgenus Vicia из секций Bithynicae (B. Fedtsch.) Maxted, Hypechusa (Alef.) Aschers. et Graebner, Microcarinae Maxted и Peregrinae Kupicha были проанализированы методом SDS-электрофореза с использованием стандартного способа экстракции белков из муки с использованием 0,025 M трис-глицинового буфера pH 8,3 при комнатной температуре и его модификаций, включающих нагревание экстракта при 80^оС или 100^оС с добавлением 2-меркаптоэтанола или без него, а также добавление ингибиторов цистеиновых и сериновых протеаз. Результаты и их обсуждение. Анализ белков семян представителей большинства секций подрода Vicia обеспечил получение информативных видоспецифичных белковых спектров, тогда как для образцов видов секции Peregrinae было характерно формирование спектров, которые свидетельствовали в пользу деградации белков, причем виды этой секции отличались по частоте встречаемости таких спектров. Так, если у семи образцов V. aintabensis Boiss & Hausskn. ex Boiss различного географического происхождения, года и места репродукции все семена давали такие спектры, в то время как у V. peregrina L. 12 из 13 образцов давали спектры частично или полностью деградированных белков, то у V. michauxii Sprengel полноценные спектры были получены для белков семян шести образцов из девяти. Изменение условий выделения белков из муки, а именно замена экстракции с использованием трис-глицинового буфера pH 8.3 при комнатной температуре на экстракцию с применением аналогичного буфера с кратковременным нагреванием при 100^оС в присутствии 2-меркаптоэтанола позволило получить полноценные белковые спектры почти у всех проанализированных образцов представителей секции Peregrinae. Белковые спектры представителей других секций вики, а также спектр белков сои, используемый в качестве стандарта при видовой идентификации бобовых, в модифицированных условиях не отличались от исходных. Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что деградация белков у видов секции Peregrinae связана с аномальной активностью эндогенных протеаз семян при стандартных условиях экстракции белков, причем данный признак детерминирован генотипически. Новая модификация метода выделения белков из семян позволяет применять общепринятые подходы, основанные на SDS-электрофорезе, к анализу генофонда видов вики секции Peregrinае и других видов Vicia.

1. Ali H.B., Osman S.A. Genetic relationship study of some Vicia species by FISH and total seed storage protein patterns. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2020;18(1):37. DOI: 10.1186/s43141-020-00054-6

2. Barratt D.H.P. Cultivar identification of Vicia faba (L.) by sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis of seed globulins. Journal of the Science of Food and Agriculture.1980;31(8):813-819. DOI: 10.1002/jsfa.2740310811

3. Bechkri S., Medoukali I., Khelifi D. Ecogeographic variability and genetic diversity associated with seed albumins, globulins and prolamins patterns in Vicia taxa from Algeria. Botanical studies. 2017;58:1-5. DOI: 10.1186/s40529-017-0177-7

4. Бобков С.В., Башкирова К.А. Изучение полиморфизма запасных белков у родителей и гибридов дикого и культурного гороха. Земледелие. 2022;(5):35-39. DOI: 10.24412/0044-3913-2022-5-35-39

5. Bosmali I., Lagiotis G., Haider N., Osathanunkul M., Biliaderis C., Madesis P. DNA-based identification of Eurasian Vicia species using chloroplast and nuclear DNA barcodes. Plants. 2022;11(7):947. DOI: 10.3390/plants11070947

6. Caputo P., Frediani M., Gelati M.T., Venora G., Cremonini R., Ruffini Castiglione M. Karyological and molecular characterisation of subgenus Vicia (Fabaceae). Plant Biosystems – An International Journal Dealing with All Aspects of Plant Biology. 2013;147(4):1242-1252. DOI: 10.1080/11263504.2013.861532

7. Dhull S.B., Kidwai M.K., Noor R., Chawla P., Rose P.K. A review of nutritional profile and processing of faba bean (Vicia faba L.). Legume Science. 2022;4(3):e129. DOI: 10.1002/leg3.129

8. Dorrian K., Mkhabela M., Sapirstein H., Bullock P. Effects of delayed harvest on wheat quality, gluten strength, and protein composition of hard red spring wheat. Cereal Chemistry. 2023;100(1):196-212. DOI: 10.1002/cche.10637

9. Егги Э.Э. Идентификация сортов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) с использованием электрофоретического спектра полипептидов белков семян: методические указания / под ред. И.П. Гаврилюк. Санкт-Петербург: ВИР; 2013.

10. Егги Э.Э. Электрофорез белков семян для сортовой идентификации высокополиморфных культур на примере козлятника восточного (Galega orientalis Lam.). Аграрная Россия. 2015;(11):14-20.

11. Егги Э.Э., Александрова Т.Г. Определение соответствия неизвестного образца вики посевной сорту Юбилейная 110 по данным морфологии и электрофореза белков семян. Зернобобовые и крупяные культуры. 2019;4(32):71-81. DOI: 10.24411/2309-348X-2019-11135

12. Егги Э.Э., Александрова Т.Г. Сравнительная характеристика сортов вики посевной (Vicia sativa subsp. sativa) по полипептидным спектрам семян. В кн.: V Вавиловская международная конференция: к 135-летию со дня рождения Н.И. Вавилова: тезисы докладов; 21-25 ноября 2022 г.; Санкт-Петербург, Россия. Санкт-Петербург: ВИР; 2022. С.353-355.

13. El-Badan G.E., Amin A.W., Ashour F.M., El-Sadek L.M. Allele frequency and genetic diversity of some species of genus Vicia L. using SDS-PAGE technique. Egyptian Journal of Botany. 2021;61(2):491-511. DOI: 10.21608/ejbo.2021.47720.1579

14. Fischer J., Becker C., Hillmer S., Horstmann C., Neubohn B., Schlereth A., Senyuk V., Shutov A., Müntz K. The families of papain- and legumain-like cysteine proteinases from embryonic axes and cotyledons of Vicia seeds: developmental patterns, intracellular localization and functions in globulin proteolysis. Plant molecular biology. 2000;43:83-101. DOI: 10.1023/A:1006456615373

15. Frediani M., Caputo P., Venora G., Ravalli C., Ambrosio M., Cremonini R. Nuclear DNA contents, rDNAs, and karyotype evolution in Vicia subgenus Vicia: II. Section Peregrinae. Protoplasma. 2005;226:181-190. DOI: 10.1007/s00709-005-0114-6

16. Hasan A.A., Haddad D.A., Ali L.M. The phylogenetic relationships between species of Vicia L. based on morphological characteristics and proteins present in seeds. Asian Journal of Research in Botany. 2023;6(2):225-232. Available from: http://science.sdpublishers.org/id/eprint/1656/1/Hasan622023AJRIB106921.pdf [accessed Jul. 19, 2024].

17. Jaaska V., Leht M. Phylogenetic relationships between and within sections Hypechusa, Narbonensis and Peregrinae of genus Vicia (Fabaceae) based on evidence from isozymes and morphology. Central European Journal of Biology. 2007;2:137-155. DOI: 10.2478/s11535-007-0008-z

18. Каховская И.А., Рудакова А.С., Шутов А.Д. Происхождение и эволюция легумаинов Аsn-специфичных протеиназ семян. В кн.: Материалы II Международной научной конференции «Тенденции развития агрофизики: от актуальных проблем земледелия и растениеводства к технологиям будущего», посвященной памяти академика Е.И. Ермакова; 02-04 октября 2019 г.; Санкт-Петербург, Россия. Санкт-Петербург: АФИ; 2019. С.358-362. URL: https://www.agrophys.ru/Media/Default/Conferences/2019/sbornik_ARI_2019.pdf [дата обращения: 19.07.2024].

19. Khalik K.N.A., Al-Gohary I.H. Taxonomic relationships in some Vicia species from Egypt, based on seed morphology and SDS-PAGE of seed proteins. Acta Scientiarum. Biological Sciences. 2013;35(4):603-611. DOI: 10.4025/actascibiolsci.v35i4.19345

20. Конарев А.В. Пищеварительные гидролазы хлебных клопов: свойства, значение и возможные пути ограничения их активности. Вестник защиты растений. 2020;103(2):65-86. DOI: 10.31993/2308-6459-2020-103-2-13279

21. Konarev Al.V., Fomicheva Yu.V. Cross analysis of the interaction of α-amylase and protease components of insects with protein inhibitors from wheat endosperm. Biochemistry (Moscow). 1991;56(4):419-427. Available from: https://www.researchgate.net/publication/235651743 [accessed Jul 19, 2024].

22. Konarev A.V., Lovegrove A. Novel detection methods used in conjunction with affinity chromatography for the identification and purification of hydrolytic enzymes or enzyme inhibitors from insects and plants. In: S. Magdeldin (ed.). Affinity Chromatography. London, UK: InTechOpen; 2012. p.187-210. Available from: https://www.intechopen.com/chapters/33056 [accessed Jul 19, 2024]. DOI: 10.5772/37618

23. Konarev A, Dolgikh V, Senderskiy I, Konarev A, Kapustkina A, Lovegrove A. Characterisation of proteolytic enzymes of Eurygaster integriceps Put. (Sunn bug), a major pest of cereals. Journal of Asia-Pacific Entomology. 2019a;22(1):379-385. DOI: 10.1016/j.aspen.2019.02.001

24. Konarev A.V., Kochetkov V.V., Bailey J.A., Shewry P.R. The detection of inhibitors of the Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary extracellular proteinases in sunflower. Journal of Phytopathology. 1999;147(2):105-108. DOI: 10.1046/j.1439-0434.1999.147002105.x

25. Конарев А.В., Лоскутов И.Г., Шеленга Т.В., Хорева В.И., Конарев Ал.В. Генетические ресурсы растений – неисчерпаемый источник продуктов здорового питания. Аграрная Россия. 2019b;(2):38-48. DOI: 10.30906/1999-5636-2019-2-38-48

26. Konarev A.V., Tomooka N., Vaughan D.A. Proteinase inhibitor polymorphism in the genus Vigna subgenus Ceratotropis and its biosystematic implications. Euphytica. 2002;123:165-177. DOI: 10.1023/A:1014920309710

27. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / под ред. В.Г. Конарева. Санкт-Петербург: ВИР; 2000).

28. Kuerban A., Al-Ghafari A.B., ALGhamadi S.A., Syed F.Q., Mirza M.B., Mohammed F.A., Abulnaja K.O., Alshaibi H.F., Alsufiani H.M., Kumosani T.A., Al-Malki A.L., Moselhy S.S. Potential antiglycation, antioxidant and antiproliferative activities of Vicia faba peptides. Journal of Food Measurement and Characterization. 2020;14:2155-2162. DOI: 10.1007/s11694-020-00462-9

29. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. DOI: 10.1038/227680a0

30. Leht M, Jaaska V. Phylogenetic position of Vicia montbretii and Lens species in relation to Vicia subgenus Cracca (Fabaceae): morphological and isozyme evidence. Feddes Repertorium. Journal of Botanical Taxonomy and Geobotany. 2019;130(3):272-288. DOI: 10.1002/fedr.201800019

31. López-Román M.I., De la Rosa L., Marcos-Prado T., Ramírez-Parra E. Cross-species transferability of SSR markers for analyzing genetic diversity of different Vicia species collections. Agronomy. 2024;14(2):326. DOI: 10.3390/agronomy14020326

32. Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. subgenus Vicia (Leguminosae, Vicieae) Botanical Journal of the Linnean Society. 1993;111(2):155-182. DOI: 10.1006/bojl.1993.1013

33. Maxted N. A phenetic investigation of Vicia section Peregrinae Kupicha (Leguminosae, Papilionoideae, Vicieae). Edinburgh Journal of Botany. 1994;51(1):75-97. DOI: 10.1017/S0960428600001736

34. Мазин А.М., Егги Э.Э. Сравнительная оценка сортообразцов клевера лугового с оригиналом сорта Псковский местный двуукосный. Кормопроизводство. 2021(6):16-21. DOI: 10.25685/KRM.2021.35.75.001

35. Mirali N. The use of SDS-PAGE seed protein variability within and among accessions to predict the mating system of some Vicia species. Journal of Genetics and Breeding. 2005;59(3/4):253.

36. Mirali N, El-Khouri S, Rizq F. Genetic diversity and relationships in some Vicia species as determined by SDS-PAGE of seed proteins. Biologia Plantarum. 2007;51(4):660-666. DOI: 10.1007/s10535-007-0139-0

37. Müntz K. Proteases and proteolytic cleavage of storage proteins in developing and germinating dicotyledonous seeds. Journal of Experimental Botany. 1996;47(5):605-622. DOI: 10.1093/jxb/47.5.605

38. Müntz K, Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Schlereth A., Tiedemann J. Stored proteinases and the initiation of storage protein mobilization in seeds during germination and seedling growth. Journal of Experimental Botany. 2001;52(362):1741-1752. DOI: 10.1093/jexbot/52.362.1741

39. Müntz K, Shutov A.D. Legumains and their functions in plants. Trends in Plant Science. 2002;7(8):340-344. DOI: 10.1016/S1360-1385(02)02298-7

40. Peršić V, Božinović I, Varnica I, Babić J, Španić V. Impact of fusarium head blight on wheat flour quality: examination of protease activity, technological quality and rheological properties. Agronomy. 2023;13(3):662. DOI: 10.3390/agronomy13030662

41. Piotrowicz-Cieślak A.I., Krupka M., Michalczyk D.J., Smyk B., Grajek H., Podyma W., Głowacka K. Physiological characteristics of field bean seeds (Vicia faba var. minor) subjected to 30 years of storage. Agriculture. 2020;10(11):545. DOI: 10.3390/agriculture10110545

42. Potokina E., Endo Y., Eggi E., Ohashi H. Electrophoretic patterns of seed proteins in the East Asian Vicia species (Leguminosae) and their systematic utility. Journal of Japanese Botany. 2003;78(1):29-37.

43. Potokina E., Vaughan D.A., Eggi E.E., Tomooka N. Population diversity of the Vicia sativa agg. (Fabaceae) in the flora of the former USSR deduced from RAPD and seed protein analyses. Genetic Resources and Crop Evolution. 2000;47:171-183. DOI: 10.1023/A:1008756420011

44. Ribeiro A.C., Teixeira A.R., Ferreira R.B. Characterization of globulins from common vetch (Vicia sativa L.). Journal of agricultural and food chemistry. 2004;52(15):4913-4920. DOI: 10.1021/jf049833p

45. Salehi B., Abu‐Reidah I.M., Sharopov F., Karazhan N., Sharifi‐Rad J., Akram M., Daniyal M., Khan F.S., Abbaass W., Zainab R., Carbone K., Fahmy N.M., Al-Sayed E., El-Shazly M., Lucarini M., Durazzo A., Santini A., Martorell M., Pezzani R. Vicia plants – A comprehensive review on chemical composition and phytopharmacology. Phytotherapy Research. 2021;35(2):790-809. DOI: 10.1002/ptr.6863

46. Schlereth A., Becker C., Horstmann C., Tiedemann J., Müntz K. Comparison of globulin mobilization and cysteine proteinases in embryonic axes and cotyledons during germination and seedling growth of vetch (Vicia sativa L.). Journal of Experimental Botany. 2000;51(349):1423-1433. DOI: 10.1093/jxb/51.349.1423

47. Scholz G., Manteufeel R., Müntz K., Rudolph A. Low‐molecular‐weight polypeptides of vicilin from Vicia faba L. are product of proteolytic breakdown. European journal of biochemistry. 1983;132(1):103-107. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1983.tb07332.x

48. Shutov A.D., Blattner F.R., Kakhovskaya I.A., Müntz K. New aspects of the molecular evolution of legumains, Asn-specific cysteine proteinases. Journal of Plant Physiology. 2012;169(3):319-321. DOI: 10.1016/j.jplph.2011.11.005

49. Идентификация сортов гороха методом электрофореза белков семян: методические указания / сост.: А.Н. Тарлаковская , Э.Э. Егги, И.П. Гаврилюк, Ж.И. Беляева; под ред. В.Г. Конарева. Ленинград: ВИР; 1990.

50. Tripathy S.K. Legume seed storage proteins – A review. Advances in Bioresearch. 2018;9(6):152-162. DOI: 10.15515/abr.0976-4585.9.6.152162

51. Warsame A.O., O’Sullivan D.M., Tosi P. Seed storage proteins of faba bean (Vicia faba L): Current status and prospects for genetic improvement. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2018;66(48):12617-12626. DOI: 10.1021/acs.jafc.8b04992

52. Wong J.H., Ng T.B. 4.60 - Plant Biochemistry: Antifungal Proteins Protecting Plants from Fungal Pathogens. In: M. Moo-Young (ed.). Comprehensive Biotechnology. (2nd ed.). Amsterdam; 2011. Vol. 4. p.745-756. DOI: 10.1016/B978-0-08-088504-9.00013-1

53. Wu F.F., Sun W., Liu F., Gao Q., Jin M., Liu B., Wang X.G. Phylogenetic relationships in Vicia subgenus Vicilla (Fabaceae) based on combined evidence from DNA sequences. Legume Research – An International Journal. 2021;44(8):882-887. DOI: 10.18805/LR-596

54. Yassen A.A.M., Taha M.G.A., Ibrahim M.M., Khalifa Y.A.M. Identification of faba bean (Vicia faba L.) protein by electrophoresis. Archives of Agriculture Sciences Journal. 2022;5(3):261-274. DOI: 10.21608/aasj.2022.286228

55. Zhu X., Hua Y., Li X., Kong X., Chen Y., Zhang C. Growing of fungi on the stored low denatured defatted soybean meals and the hydrolysis of proteins and isoflavone glycosides by fungal enzymes. Food Research International. 2023;163:112261. DOI: 10.1016/j.foodres.2022.112261