Разработка мультиплексного набора микросателлитных маркеров для генетической идентификации черной смородины (Ribes nigrum L.)

Актуальность. Для черной смородины (Ribes nigrum L.) к настоящему времени не предложена эффективная технология генетической идентификации сортообразцов. В частности, существующие решения с использованием микросателлитных маркеров предполагают амплификацию отдельных локусов в нескольких пробирках, что относительно ресурсоемко и требует оптимизации. Материалы и методы. Проанализированы имеющиеся решения для генетической идентификации сортообразцов черной смородины с использованием микросателлитных локусов. Отобрано восемь маркеров, расположенных в различных группах сцепления (g1-K04, g2-J08, e4-D03, g2-L17, e3-B02, g1-A01, e1-O01 и g2-G12). В ходе работы оптимизированы набор маркеров с непересекающимися длинами фрагментов, состав и температурный профиль полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющие проводить амплификацию данных маркеров «в одной пробирке». Методика была протестирована на 33 сортообразцах генетической коллекции черной смородины Свердловской селекционной станции садоводства. Результаты. Подобраны условия проведения ПЦР и флуорохромы, позволяющие проводить амплификацию данных маркеров «в одной пробирке» и получать неперекрывающиеся длины фрагментов. Получены генетические профили 33 сортообразцов, по которым можно провести их однозначную идентификацию. Число аллелей в отобранных локусах составило от трех до одиннадцати. Заключение. Впервые предложена мультиплексная реакция, которая позволяет проводить оценку изменчивости восьми локусов  смородины черной «в одной пробирке». Интерес представляет тестирование предложенной технологии на широком спектре сортообразцов черной смородины, полученных в различных регионах мира, а также на других видах рода Ribes, используемых в селекции черной смородины.

1. Antonius K., Karhu S., Kaldmae H., Lacis G., Rugenius R., Baniulis D., Sasnauskas A., Schulte E., Kuras A., Korbin M., Gunnarsson A., Werlemark G., Ryliskis D., Todam-Andersen T., Kokk L., Jarve K. Development of the Northern European Ribes core collection based on a microsatellite (SSR) marker diversity analysis. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization. 2012;10(1):70-73. DOI: 10.1017/S1479262111000980

2. Bassil N., Bidani A., Nyberg A., Hummer K., Rowland L.J. Microsatellite markers confirm identity of blueberry (Vaccinium spp.) plants in the USDA-ARS National Clonal Germplasm Repository collection. Genetic resources and crop evolution. 2020;67:393-409. DOI: 10.1007/s10722-019-00873-8

3. Brennan R., Jorgensen L., Hackett C., Woodhead M., Gordon S., Russell J. The development of a genetic linkage map of black currant (Ribes nigrum L.) and the identification of regions associated with key fruit quality and agronomic traits. Euphytica. 2008;161:19-34. DOI: 10.1007/s10681-007-9412-8

4. Brennan R., Jorgensen L., Woodhead M., Russell J. Development and characterization of SSR markers in Ribes species. Molecular Ecology Notes. 2002;2:327-330. DOI: 10.1046/j.1471-8286.2002.00233.x

5. Cavanna M., Marinoni D.T., Beccaro G.L., Bounous G. Microsatellite-based evaluation of Ribes spp. germplasm. Genome. 2009;52(10):839-848. DOI: 10.1139/G09-057

6. Cmejlova J., Rejlova M., Paprstein F., Cmejla R. A new one-tube reaction kit for the SSR genotyping of apple (Malus × domestica Borkh.). Plant science. 2021;303:110768. DOI: 10.1016/j.plantsci.2020.110768

7. COrDIS Cattle. Reagent kit for multiplex analysis of 15 microsatellite markers of cattle. LLC "GORDIZ". Moscow, Russia. Available from https://gordiz.ru/en/products/animal-kits/cordis-cattle/ [accessed Sept. 6, 2024].

8. Devey M.E., Bell J.C., Smith D.N., Neale D.B., Moran G.F. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers. Theoretical and applied genetics. 1996;92:673-679. DOI: 10.1007/BF00226088

9. Должикова М.А., Пикунова А.В., Толпекина А.А., Князев С.Д., Бахотская А.Ю. Идентификация сортов смородины черной (Ribes nigrum L.) на основании полиморфизма микросателлитных локусов. Вестник Российской сельскохозяйственной науки. 2020;3:26-29. DOI: 10.30850/vrsn/2020/3/26-29

10. Габышева Н.С. Оценка исходного селекционного материала смородины черной. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2019;49(5):21-27. DOI: 10.26898/0370-8799-2019-5-3

11. Galinskaya T.V., Schepetov D.M., Lysenkov S.N. Prejudices against microsatellite studies and how to resist them. Russian Journal of Genetics. 2019;55(6):657-671. DOI: 10.1134/S1022795419060048

12. Hedrick P.W. Genetics of populations. London; 2010.

13. ICAR guidelines. Section 4 – DNA technology. Version: February 2022. [Available from: https://www.icar.org/Guidelines/04-DNA-Technology.pdf [accessed Sept. 13, 2024].

14. Князев С.Д., Бахотская А.Ю. Генетическое разнообразие смородины черной сортов селекции ВНИИСПК. Плодоводство и ягодоводство России. 2018;54:47-51. DOI: 10.31676/2073-4948-2018-54-47-51

15. Князев С.Д., Левгерова Н.С., Макаркина М.А., Пикунова А.В., Салина Е.С., Чекалин Е.И., Янчук Т.В., Шавыркина М.А. Селекция черной смородины: методы, достижения, направления. Орел: ВНИИСПК; 2016.

16. Князев С.Д., Огольцова Т.П. Селекция черной смородины на современном этапе. Орел: Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина; 2004.

17. Modorov M., Monakhov V., Mikryukov V., Erokhin N., Tkachenko I., Polezhaeva M., Ranyuk M. Microsatellite multiplex assay for sable (Martes zibellina) and pine marten (Martes martes). Mammal research. 2020;65(4):855-862. DOI: 10.1007/s13364-020-00529-4

18. Lu G., Wang W., Zhang S. Yang G., Zhang K., Que Y., Deng L. The first complete mitochondrial genome of Grossulariaceae: Molecular features, structure recombination, and genetic evolution. BMC Genomics. 2024;25:744. DOI: 10.1186/s12864-024-10654-y

19. Межнина О.А., Урбанович О.Ю. Анализ вариабельности микросателлитных локусов у представителей рода смородины (Ribes L.), выращиваемых в Беларуси. Весці Нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. Серыя біялагічных навук. 2017;3:45-54.

20. Montanari C., Deng C., Koot E., Bassil N.V., Zurn J.D., Morrison-Whittle P., Worthington M.L, Aryal R., Ashrafi H., Pradelles J., Wellenreuther M., Chagné D. A multiplexed plant-animal SNP array for selective breeding and species conservation applications. G3: Genes|genomes|genetics. 2023;13(10):2160-1836. DOI: 10.1093/g3journal/jkad170

21. Palmieri L., Grando M.S., Sordo M., Grisenti M., Martens S., Giongo L. Establishment of molecular markers for germplasm management in a worldwide provenance Ribes spp. сollection. Plant Omics. 2013;6(3):165–174.

22. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular ecology notes. 2006;6:288-295. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x

23. Петрова С.Н., Кузнецова А.А. Состав плодов и листьев смородины черной Ribes nigrum (обзор). Химия растительного сырья. 2014;4:43-50. DOI: 10.14258/jcprm.201404221

24. Пикунова А.В., Князев С.Д., Бахотская А.Ю., Кочумова А.А. Полиморфизм микросателлитных локусов у сортов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции ВНИИСПК. Сельскохозяйственная биология. 2015;50(1):46-54. DOI: 10.15389/agrobiology.2015.1.46rus

25. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. ПЦР в реальном времени/ под ред. Д.В. Ребрикова. Москва: Лаборатория знаний; 2023.

26. Russell J., Hackett Ch., Hedley P., Liu H., Milne L., Bayer M., Marshall D., Jorgensen L., Gordon S., Brennan R. The use of genotyping by sequencing in black currant (Ribes nigrum): developing high-resolution linkage maps in species without reference genome sequences. Molecular breeding: new strategies in plant improvement. 2014;33:835-849. DOI: 10.1007/s11032-013-9996-8

27. Сазонов Ф.Ф. Селекция смородины черной в условиях юго-западной части Нечерноземной зоны России. Москва: Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук; 2018.

28. Sekridova A.V., Shilov I.A., Kislin E.N., Malyuchenko O.P., Kharchenko P.N. The technology of genetic identification of varieties and wild-growing forms of grapes based on multilocus microsatellite analysis. Applied Biochemistry and Microbiology. 2022;58(9):1050-1059. DOI: 10.1134/S0003683822090083

29. Sun X., Zhan Y., Li S., Liu Y., Fu Q., Quan X., Xiong J., Gang H., Zhang L., Qi H., Wang A., Huo J., Qin D., Zhu C. Complete chloroplast genome assembly and phylogenetic analysis of black currant (Ribes nigrum), red and white currant (Ribes rubrum), and gooseberry (Ribes uva-crispa) provide new insights into the phylogeny of Grossulariaceae. PeerJ. 2023;11:e16272. DOI: 10.7717/peerj.16272

30. Testolin R., Messina R., Cipriani G., De Mori G. SSR-based DNA fingerprinting of fruit crops. Crop Science. 2022;63:390-459. DOI: 10.1002/csc2.20896

31. Waits L.P., Luikart G., Taberlet P. Estimating the probability of identity among genotypes in natural populations: cautions and guidelines. Molecular Ecology. 2001;10(1):249-256. DOI: 10.1046/j.1365-294X.2001.01185.x

32. Zurn J.D., Nyberg A., Montanari S., Postman J., Neale D., Bassil N. A new SSR fingerprinting set and its comparison to existing SSR- and SNP-based genotyping platforms to manage Pyrus germplasm resources. Tree Genetics & Genomes. 2020;16:72. DOI: 10.1007/s11295-020-01467-7