Генотипирование линий генетической коллекции подсолнечника ВИР с использованием аллель-специфичных маркеров локуса Rf1

Актуальность. При создании промышленных гибридов подсолнечника (Helianthus annuus L.) преимущественно используется генетическая система ЦМС-Rf на основе цитоплазматической мужской стерильности РЕТ1-типа. Ключевым геном в селекции гибридов является Rf1, необходимый для восстановления фертильности пыльцы растений F₁. Эффективным инструментом для идентификации генотипов родительских линий по локусу Rf1, контроля однородности, а также определения генетической чистоты партий гибридных семян являются молекулярно-генетические маркеры, апробированные на различном генетическом материале. В настоящем исследовании для идентификации генотипов линий генетической коллекции подсолнечника ВИР и межлинейных гибридов F₂ использованы доступные из литературных источников аллель-специфичные маркеры генов-кандидатов локуса Rf1. Материал и методы. Изучены две выборки генотипов: 46 линий генетической коллекции подсолнечника ВИР, ранее охарактеризованных в полевых опытах по способности к восстановлению фертильности пыльцы, и 80 фенотипированных по признакам фертильности/стерильности растений, из расщепляющихся популяций F₂ от скрещиваний линии ЦМС ВИР 116А с восстановителями фертильности ВИР 740 и RIL 130. Линии различались по типу цитоплазмы и наличию SCAR-маркера HRG02, тесно сцепленного с локусом Rf1. Линии генотипированы с использованием маркеров, специфичных для доминантного (PPR621.5R, SRF833, 67N04_P_170) и рецессивного (PPR621.5M, 67N04_P_155) аллелей генов-кандидатов Rf1. Маркерные фрагменты PPR621.5M и PPR621.5 R, амплифицированные у шести генотипов, были выделены и секвенированы. Результаты. Нуклеотидные последовательности маркеров PPR621.5М и PPR621.5R отличались по четырём SNP и были полностью идентичными с опубликованными в литературе. У линий ЦМС и большинства закрепителей стерильности идентифицированы маркеры PPR621.5М и 67N04_P_155, специфичные для аллеля rf1. Девятнадцать из 21 линии, характеризовавшейся стерильной цитоплазмой и наличием маркера HRG02, имели по три маркера, специфичных для доминантного аллеля; у двух линий обнаружены по два аллель-специфичных маркера. У четырёх из семи восстановителей фертильности (стерильная цитоплазма, без маркера HRG02) выявлено по два или три маркера, специфичных для доминантного аллеля, у трёх линий идентифицированы лишь маркеры рецессивного аллеля. Обнаружены генотипы F₂, возникшие в результате рекомбинации между SCAR-маркером HRG02 и аллель-специфичными маркерами. Заключение. Подтверждены эффективность аллель-специфичных маркеров генов-кандидатов локуса Rf1 для генотипирования линий подсолнечника и их диагностическая ценность для отбора целевых генотипов из расщепляющихся гибридных популяций.

1. Abratti G., Bazzalo M.E., Leon A. Mapping a novel fertility restoration gene in sunflower. In: Proceedings of the 17th International Sunflower Conference; 2008 June 8-12; Cordoba, Spain. Consejería de Agricultura y Pesca; 2008. Vol. 2. P. 617-621. Available from https://www.isasunflower.org/fileadmin/documents/aaProceedings/17thISC_CordobaVol2/617sonia.pdf [accessed Nov. 15, 2024]

2. Анащенко А.В., Дука М.В. Изучение генетической системы ЦМС-Rf у подсолнечника (Helianthus annuus L.). Сообщение II. Восстановление мужской фертильности у гибридов на основе ЦМС. Генетика. 1985;21(12):1999-2004.

3. Анисимова И.Н., Карабицина Ю.И., Алпатьева Н.В., Кузнецова Е.Б., Титов Н.В., Лютко А.Ю., Гаврилова В.А. Диагностическая ценность молекулярных маркеров гена Rf1 подсолнечника. Биотехнология и селекция растений. 2021;4(2):28-37. DOI: 10.30901/2658-6266-2021-2-o3

4. Badouin H., Gouzy J., Grassa C.J., Murat F., Staton S.E., Cottret L., Lelandais-Brière C., Owens G.L., Carrère S., Mayjonade B., Legrand L., Gill N., Kane N.C., Bowers J.E., Hubner S., Bellec A., Bérard A., Bergès H., Blanchet N., Boniface M-C., Brunel D., Catrice O., Chaidir N., Claudel C., Donnadieu C., Faraut T., Fievet G., Helmstetter N., King M., Knapp S.J., Lai Z., Le Paslier M-C., Lippi Y., Lorenzon L., Mandel J.R., Marage G., Marchand G., Marquand E., Bret-Mestries E., Morien E., Nambeesan S., Nguyen T., Pegot-Espagnet P., Pouilly N., Raftis F., Sallet E., Schiex T., Thomas J., Vandecasteele C., Varès D., Vear F., Vautrin S., Crespi M., Mangin B., Burke J.M., Salse J., Muños S., Vincourt P., Loren H. Rieseberg L.H., Langlade N.B. The sunflower genome provides insights into oil metabolism, flowering and Asterid evolution. Nature. 2017;546:148-152. DOI: 10.1038/nature22380

5. Baute G.J., Kane N.C., Grassa C.J., Lai Z., Rieseberg L.H. Genome scans reveal candidate domestication and improvement genes in cultivated sunflower, as well as post-domestication introgression with wild relatives. New Phytologist. 2015;206(2):830-838. DOI: 10.1111/nph.13255

6. Choudhari A.K., Bagade A.B. Diverse cytosteriles in sunflower: a review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2019;8(11):1641-1644. DOI: 10.20546/ijcmas.2019.811.189

7. Feng J., Jan C.C. Introgression and molecular tagging of Rf4, a new male fertility restoration gene from wild sunflower Helianthus maximiliani L. Theoretical and Applied Genetics. 2008;117(2):241. DOI: 10.1007/s00122-008-0769-4

8. Гаврилова В.А., Анисимова И.Н., Алпатьева Н.В., Рожкова В.Т., Ступникова Т.Г., Карабицина Ю.И., Кузнецова Е.Б. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 853. Генетическая коллекция подсолнечника. Санкт-Петербург: ВИР; 2017.

9. Goryunov D.V., Anisimova I.N., Gavrilova V.A., Chernova A.I., Sotnikova E.A., Martynova E.U., Boldyrev S.V., Ayupova A.F., Gubaev R.F., Mazin P.V., Gurchenko E.A., Shumskiy A.A., Petrova D.A., Garkusha S.V., Mukhina Z.M., Benko N.I., Demurin Y.N., Khaitovich P.E., Goryunova S.V. Association mapping of fertility restorer gene for CMS PET1 in sunflower. Agronomy. 2019;9(2):49. DOI: 10.3390/agronomy9020049

10. Heiser C.B. Hybridization in the annual sunflowers: Helianthus annuus × H. debilis var. cucumerifolius. Evolution. 1951;5(1):42-51. DOI: 10.2307/2405429

11. Horn R., Köhler R.H., Zetsche K. A mitochondrial 16 kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower. Plant Molecular Biology. 1991;17(1):29-36. DOI: 10.1007/BF00036803

12. Horn R., Kusterer B., Lazarescu E., Prüfe M., Friedt W. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring fertility in PET1-based F1 hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2003;106:599-606. DOI: 10.1007/s00122-002-1078-y

13. Horn R., Radanovic A., Fuhrmann L., Sprycha Y., Hamrit S., Jockovic M., Miladinovic D., Jansen C. Development and validation of markers for the fertility restorer gene Rf1 in sunflower. International Journal of Molecular Sciences. 2019:20(6):1260. DOI: 10.3390/ijms20061260

14. Jan C.C., Vick B.A., Miller J.F., Kahler A.L., Butler E.T. Construction of an RFLP linkage map for cultivated sunflower. Theoretical and Applied Genetics. 1998;96(1):15-22. DOI: 10.1007/s001220050703

15. Jan C.C., Vick B.A. Inheritance and allelic relationships of fertility restoration genes for seven new sources of male-sterile cytoplasm in sunflower. Plant Breeding. 2007;126(2):213-217. DOI: 10.1111/j.1439-0523.2007.01350.x

16. Karabitsina Y.I., Gavrilova V.A., Alpatieva N.V., Kuznetsova E.B., Anisimova I.N. Peculiarities of inheritance of pollen fertility restoration trait in sunflower with cytoplasmic male sterility. Russian Journal of Genetics. 2019;55:1375-1382. DOI: 10.1134/S1022795419110073

17. Kinman M.L. New developments in the USDA and state experiment station sunflower breeding programs. In: Proceedings of the 4th International Sunflower Conference; 1970 June 23-25; Memphis, Tennessee, USA. 1970. P. 181-183. Available at: https://www.isasunflower.org/ fileadmin/documents/Proceedings/4thISC1970/T1970BRE08.pdf [accessed Nov. 15, 2024].

18. Leclerq P. Une sterilite cytoplasmique chez le tournesol. Annales de l'Amélioration des Plantes. 1969;19(2):99-106. [In French]

19. Li J.T., Yang J., Chen D.C., Zhang X.I., Tang Z.S. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower. Genetics and Molecular Research. 2007;6(4):1064-1071.

20. Liu Z., Mulpuri S., Feng J., Vick B.A., Jan C.-C. Molecular mapping of the Rf3 fertility restoration gene to facilitate its utilization in breeding confection sunflower. Molecular Breeding. 2012;29:275-284. DOI: 10.1007/s11032-011-9563-0

21. Liu Z., Wang D., Feng J., Seiler G.J., Cai X., Jan C.-C. Diversifying sunflower germplasm by integration and mapping of a novel male fertility restoration gene. Genetics. 2013;193(3):727-37. DOI: 10.1534/genetics.112.146092

22. Liu Z., Zhang L., Seiler G.J., Jan C.-C. Molecular mapping of theRf9 gene from RCMG 1 for CMS ANN3 derived from wild sunflower (Helianthus annuus L.). Euphytica. 2023;219:46. DOI: 10.1007/s10681-023-03176-3

23. NCBI. National Center for Biotechnology Information. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov [accessed Nov. 15, 2024].

24. Oil seed sunflower description of released restorer line germplasm. Available from: https://www.ag.ndsu.edu/fss North Dakota Foundation Seedstocks [accessed Nov. 15, 2024].

25. Polivanova O.B., Sivolapova A.B., Goryunov D.V., Fedorova A.V., Sotnikova E.A., Chebanova Y.V., Karabitsina Y.U.; Benko N.I., Demurin Y.N., Goryunova S.V. Structural diversity of sunflower (Helianthus annuus L.) candidate Rf1 loci based on gene-specific PCR. Research on Crops. 2021;22(1):40-46. DOI: 10.31830/2348-7542.2021.034

26. Qi L.L., Seiler G.J., Hulke B.S., Vick B.A., Gulya T.J. Genetics and mapping of the R11 gene conferring resistance to recently emerged rust races, tightly linked to male fertility restoration, in sunflower (Helianthus annuus L.). Theoretical and Applied Genetics. 2012;125:921-932. DOI: 10.1534/genetics.112.146092

27. Radanovi´c A.; Sprycha Y.; Jockovi´c M.; Sundt M.; Miladinovi´c D.; Jansen C.; Horn R. KASP markers specific for the fertility restorer locus Rf1 and application for genetic purity testing in sunflowers (Helianthus annuus L.). Genes. 2022;13:465. DOI: 10.3390/genes13030465

28. Sajer O., Schirmak U., Hamrit S., Horn R. Mapping of the new fertility restorer gene Rf-PET2 close to Rf1 on linkage group 13 in sunflower (Helianthus annuus L.). Genes. 2020;11:269. DOI: 10.3390/genes11030269

29. Schnabel U., Engelmann U., Horn R. Development of markers for the use of the PEF1 cytoplasm in sunflower hybrid breeding. Plant Breeding. 2008;127(6):587-591. DOI: 10.1111/j.1439-0523.2008.01516.x

30. Serieys H. Identification, study, utilization in breeding programs of new CMS sources. In: Proceedings of the Sunflower Subnetwork Progress Report; 2005 July 17-20; Novi Sad, Serbia and Montenegro. Rome, Italy: FAO. 2005. P. 47-53.

31. Sivolapova A.B., Polivanova O.B., Goryunov D.V., Chebanova Y.V., Fedоrova A.V., Sotnikova E.A., Karabitsina Y.I., Benko N.I., Mukhina Z.M., Anisimova I.N., Demurin Y.N., Goryunova S.V. Refinement of Rf1-gene localization and development of the new molecular markers for fertility restoration in sunflower. Molecular Biology Reports. 2023;50(9):7919-7926. DOI: 10.1007/s11033-023-08646-4

32. Talukder Z., Ma G., Hulke B., Jan C.-C., Qi L. Linkage mapping and genome-wide association studies of the Rf gene cluster in sunflower (Helianthus annuus L.) and their distribution in world sunflower collections. Frontiers in Genetics. 2019;10:216. DOI: 10.3389/fgene.2019.00216

33. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Шумный В.К. Использование системы ЦМС-Rf в гибридной селекции подсолнечника. Письма в Вавиловский журнал генетики и селекции. 2024;10(2):119-131. DOI: 10.18699/letvjgb-2024-10-14

34. Yue B., Vick B.A., Cai X., Hu J. Genetic mapping for the Rf1 (fertility restoration) gene in sunflower (Helianthus annuus L.) by SSR and TRAP markers. Plant Breeding. 2010;129:24-28. DOI: 10.1111/j.14390523.2009.01661.x