Создание линии табака со сниженными антифидантными свойствами по отношению к колорадскому жуку

Актуальность. Модификация растений с целью повышения их устойчивости к вредителям – перспективное направление в современной биотехнологии. Создание искусственных защитных систем на основе РНК-интерференции или индукция метаболических изменений в растениях могут существенно снизить привлекательность для вредителя и, как следствие, степень повреждения растений. Однако, разработка стратегий подобных модификаций затруднена отсутствием биотехнологических методов, разработанных для каждой культуры, и адекватных моделей для проведения таких исследований. Табак Nicotiana tabacum L. как растение семейства пасленовых потенциально может быть моделью для исследования возможных стратегий повышения устойчивости к вредителям для таких родственных культур как картофель, томат, сладкий перец и т.д. Препятствием к проведению подобных работ на табаке является высокая токсичность листьев, которая защищает табак от большинства вредителей. Недавно опубликованы исследования, доказывающие, что мутагенез генов семейства Berberine Bridge-Like (BBL) в табаке приводит к существенным изменениям в количественном и качественном составе алкалоидов в листьях. В настоящей работе данный подход был применен с целью получения растений табака, пригодных для потребления в пищу колорадским жуком (Leptinotarsa decemlineata Say), который является наиболее распространенным и опасным вредителем картофеля. Результаты. С целью модификации генома табака, были подобраны две направляющие РНК (нРНК), нацеленные на шесть генов семейства BBL. Каждая из них была встроена в вектор, содержащий ген нуклеазы Cas9 и каркас нРНК. Полученные конструкции вместе с плазмидой pBI121, содержащей ген устойчивости к канамицину nptII и репортерный ген бета-глюкуронидазы Escherichia coli Migula, были использованы для трансформации листовых эксплантов табака методом биобаллистики. Из трансформированных клеток путем селекции на канамицине были получены каллусы и далее трансгенные растения-регенеранты поколения Т0. Неожиданным результатом стало появление широкого плейотропного эффекта модификации в виде многочисленных серьезных аномалий развития среди полученных популяций регенерантов. Самые тяжелые аномалии проявлялись в виде быстрой гибели растений, относительно жизнеспособные растения отличались угнетением роста и укоренения, увеличением числа междоузлий, изменением формы листьев, ускоренным цветением, аномалиями развития цветка и стерильностью. Только одна из семи полученных популяций клонов обладала достаточной жизнеспособностью для выращивания в гидропонном комплексе и существенно не отличалась от исходного сорта по жизнеспособности in vitro. Из этой популяции была выделена линия табака NtaBBL5-14, поддерживаемая in vitro. Данная линия была протестирована на кормовую пригодность для колорадского жука. Показано, что личинки колорадского жука эффективно потребляют листья табака полученной линии, и практически не потребляют листья контрольных растений (процент потребления 97±0.5% для модифицированных и 9±3% для контрольных растений). Заключение. Методом модификации генома получена линия табака, пригодная для питания личинок колорадского жука. В дальнейшем эта линия может быть использована как модель для исследования взаимодействия колорадского жука и растений. Результаты работы демонстрируют возможность менять спектр кормовых предпочтений вредителей и открывают перспективы развития данного направления. В частности, перспективным может быть осуществление модификаций с меньшим плейотропным эффектом, и, возможно, этого можно добиться, производя нокаут других генов, участвующих в регуляции синтеза никотина.

никотин, Nicotiana tabacum, Leptinotarsa decemlineata, токсичность, семейство генов BBL, Cas9, нРНК

1. Alyokhin A., Baker M., Mota-Sanchez D., Dively G., Grafius E. Colorado Potato Beetle Resistance to Insecticides. American Journal of Potato Research. 2008;85:395413. DOI: 10.1007/s12230-008-9052-0.

2. Chen P.-Y., Wang C.-K., Soong S.-C., To K.-Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Molecular Breeding. 2003;11:287-293. DOI: 10.1023/A:1023475710642

3. Домрачев, Д.В., Егорова, А.А., Колошина, К.А., Герасимова, С.В. Постановка методики анализа содержания алкалоидов в тканях некоторых видов семейства пасленовых методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В кн.: Объединенное научное мероприятие "День поля" в рамках ФАНО России "Развитие селекции и семеноводства картофеля" и научная конференция "Теоретические основы и прикладные исследования в селекции и семеноводстве картофеля": тезисы докладов, г. Новосибирск, Россия, 1-5 августа 2018 г. Новосибирск; 2018. С.15). DOI: 10.18699/Potato-2018-11

4. Fauser F., Schiml S., Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 2014;79:348-359. DOI: 10.1111/tpj.12554

5. Hsiao T.H., Fraenkel G. The Role of Secondary Plant Substances in the Food Specificity of the Colorado Potato Beetle. Annals of the Entomological Society of America. 1968;61(2):485-493. DOI: 10.1093/aesa/61.2.485

6. Иванова К.А., Спаселикова А.В., Шумный В.К., Герасимова С.В. Генымишени для метаболической инженерии представителей семейства Solanaceae: эволюция и структурная организация. Биотехнология и селекция растений. 2018;1(1):34-42.). DOI: 10.30901/2658-6266-2018-1-34-42

7. Kajikawa M., Shoji T., Kato A., Hashimoto T. Vacuole-Localized Berberine Bridge Enzyme-Like Proteins Are Required for a Late Step of Nicotine Biosynthesis in Tobacco. Plant Physiology. 2011;155:2010-2022. DOI: 10.1104/pp.110.170878.

8. Lewis R.S., Drake-Stowe K.E., Heim C., Steede T., Smith W., Dewey R.E. Genetic and Agronomic Analysis of Tobacco Genotypes Exhibiting Reduced Nicotine Accumulation Due to Induced Mutations in Berberine Bridge Like (BBL) Genes. Frontiers in Plant Science. 2020;11. DOI: 10.3389/fpls.2020.00368

9. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15:473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

10. Schachtsiek J., Stehle F. Nicotine-free, nontransgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) edited by CRISPR/Cas9. Plant Biotechnology Journal. 2019;17:2228-2230. DOI: 10.1111/pbi.13193

11. Sierro N., Battey J.N.D., Ouadi S., Bakaher N., Bovet L., Willig A., et al. The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communications. 2014;5:3833. DOI: 10.1038/ncomms4833

12. Weber D. Colorado beetle: pest on the move. Pesticide Outlook. 2003;14(6):256-259. DOI: 10.1039/b314847p