Протокол получения трансформантов вигны Vigna unguiculata (L.) Walp. – носителей редактирующих конструкций

Актуальность. Для трансформации клеток высших растений чаще всего используют метод агробактериальной трансформации, при этом важное значение имеет выбор экспланта, состав питательных сред для отбора и регенерации трансформантов. Вигна Vigna unguiculata (L.) Walp., представитель семейства Бобовых, относится к культурам, сложно поддающимся трансформации в связи с низким регенерационным потенциалом после инокуляции агробактерией. Поиск генотипов, отличающихся высокой степенью регенерации, а также составление эффективного протокола агробактериальной трансформации являются актуальной задачей для доставки компонентов системы редактирования. Цель настоящего исследования – разработать эффективный протокол получения трансформантов вигны – носителей редактирующих конструкций. Материалы и методы. Разработку эффективного протокола получения трансформантов вигны для доставки компонентов системы редактирования осуществляли при использовании образцов коллекции ВИР. В качестве эксплантов использовали части семядольного узла. Для увеличения площади раневой поверхности эксплант формировали путем продольного разреза семядольного узла. Агробактериальную трансформацию проводили при использовании генетической конструкции, созданной на основе вектора pKSE401 с компонентами системы редактирования CRISPR/Cas9. Индукцию органогенеза осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 6-бензиламинопурина. В статье описан пошаговый протокол для эффективного получения фертильных трансформантов вигны. Результаты и обсуждение. Мы экспериментально подтвердили способность части семядольного узла вигны к органогенезу побегов в культуре in vitro, а также возможность использования их в качестве эксплантов для агробактериальной трансформации с достижением частоты фертильных трансформантов на уровне 6,2% для генотипа к-642. Сравнение эффективности трансформации с данными предшествующих работ по агробактериальной трансформации вигны указывает на лучший выход трансформантов на основе предложенного нами протокола. Поскольку протокол валидирован в эксперименте с вектором, несущим компоненты системы редактирования CRISPR/Cas9, его можно рекомендовать для использования в работах по получению редактированных растений вигны. Заключение. Полученные результаты агробактериальной трансформации модифицированного типа эксплантов вигны свидетельствуют о возможности успешного использования представленного протокола для генетической трансформации данной культуры. Генотип к-642, показавший эффективность не только на этапах регенерации и трансформации, но также на стадиях укоренения и последующей адаптации растений к нестерильным условиям, может быть рекомендован для дальнейших фундаментальных исследований вигны при помощи методов обратной генетики.

1. Behura R., Kumar S., Saha B., Panda M.K., Dey M., Sadhukhan A., Mishra S., Alam S., Sahoo D.P., Sugla T., Sahoo L. Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.]. In: Methods in Molecular Biology. Vol. 1223. K. Wang (ed.) Agrobacterium Protocols. Vol. 1, Ch. 20. New York, NY: Springer Humana Press; 2014. p.255-264. DOI: 10.1007/978-1-4939-1695-5_20

2. Bett B., Gollasch S., Moore A., Harding R., Higgins T.J.V. An improved transformation system for cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) via sonication and a kanamycin-geneticin selection regime. Frontiers in Plant Science. 2019;10:219. DOI: 10.3389/fpls.2019.00219

3. Бурляева М.О., Гуркина М.В., Чебукин П.А. Скрининг образцов спаржевой вигны (Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis (L.) Verdc.) из коллекции ВИР на устойчивость к абиотическим и биотическим стрессорам. Селекция и семеноводство овощных культур. 2014;45:131-141.

4. Che P., Chang S., Simon M.K., Zhang Z., Shaharyar A., Ourada J., O’Neill D., Zhang Z., Torres-Mendoza M., Guo Y., Marasigan K.M, Vielle-Calzada J.-P., Ozias-Akins P., Albertsen M.C., Jones T.J. Developing a rapid and highly efficient cowpea regeneration, transformation and genome editing system using embryonic axis explants. The Plant Journal. 2021;106(3):817-830. DOI: 10.1111/tpj.15202

5. Ефремова О.С., Шкрыль Ю.Н., Веремейчик Г.Н. Регенерационный потенциал in vitro сортов сои (Glycine max (L.) Merr.) при агробактериальной трансформации. Аграрный вестник Приморья. 2017;4(8):21-23.

6. Gerasimova S.V., Kolosovskaya E.V., Vikhorev A.V., Korotkova A.M., Hertig C.W., Genaev M.A., Domrachev D.V., Morozov S.V., Chernyak E.I., Shmakov N.A., Vasiliev G.V., Kochetov A.V., Kumlehn J., Khlestkina E.K. WAX INDUCER 1 Regulates β-Diketone Biosynthesis by Mediating Expression of the Cer-cqu gene cluster in barley. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24:6762. DOI: 10.3390/ijms24076762

7. Ignacimuthu S. Agrobacterium mediated transformation of Vigna sesquipedalis Koern (asparagus bean). Indian journal of experimental biology. 2000;38(5):493–498.

8. Integrated DNA Technologies. PrimerQuest™ Tool. Available from: https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest [accessed Febr. 01, 2024].

9. Ji J., Zhang C., Sun Z., Wang L., Duanmu D., Fan Q. Genome editing in cowpea Vigna unguiculata using CRISPR-Cas9. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20(10):2471. DOI: 10.3390/ijms20102471

10. Juranić M., Nagahatenna D.S.K., Salinas-Gamboa R., Hand M.L., Sánchez León N., Leong W.H., How T., Bazanova N., Spriggs A., Vielle Calzada J.-P., Koltunow A.M.G. A Detached leaf assay for testing transient gene expression and gene editing in cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.). Plant Methods. 2020;16:88. DOI: 10.1186/s13007-020-00630-4

11. Jyothishwaran G., Kotresha D., Selvaraj T., Srideshikan S.H., Rajvanshi P.K., Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science. 2007;93(6):770-772.

12. Krylova E.A., Burlyaeva M.O., Tvorogova V.E., Khlestkina E.K. Contrast relative humidity response of diverse cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) genotypes: deep study using RNAseq approach. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25:11056. DOI: 10.3390/ijms252011056

13. Mao J.Q., Zaidi M.A., Arnason J.T., Altosaar I. In vitro regeneration of Vigna unguiculata (L.) Walp. cv. Blackeye cowpea via shoot organogenesis. Plant Cell Tissue Organ Culture. 2006;87:121-125. DOI: 10.1007/s11240-006-9145-8

14. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15:473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

15. Muthukumar B., Mariamma M., Veluthambi K., Gnanam A. Genetic transformation of cotyledon explants of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Report. 1996;15:980-985. DOI: 10.1007/BF00231600

16. Pal J.K., Kumar S., Singh M. Genetic transformation of Vigna unguiculata tissue by Agrobacterium tumifaciens. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2011;71(1):84-86.

17. Popelka J.C., Gollasch S., Moore A., Molvig L., Higgins T.J. Genetic transformation of cowpea (Vigna unguiculata L.) and stable transmission of the transgenes to progeny. Plant Cell Reports. 2006;25(4):304-312. DOI: 10.1007/s00299-005-0053-x

18. Pratap A., Prajapati U., Singh C.M., Gupta S., Rathore M., Malviya N., Tomar R., Gupta A.J., Tripathi S., Singh N.P. Potential, constraints and applications of in vitro methods in improving grain legumes. Plant Breeding. 2018;137:235-249. DOI: 10.1111/pbr.12590

19. Razgonova M.P., Burlyaeva M.O., Zinchenko Y.N., Krylova E.A., Chunikhina O.A., Ivanova N.M., Zakharenko A.M., Golokhvast K.S. Identification and spatial distribution of bioactive compounds in seeds Vigna unguiculata (L.) Walp. by laser microscopy and tandem mass spectrometry. Plants. 2022;11:2147. DOI: 10.3390/ plants11162147

20. Sahoo L., Sugla T., Jaiwal P.K. In vitro regeneration and genetic transformation of cowpea, mungbean, urdbean and azuki bean In: P.K. Jaiwal; R.P. Singh (eds). Applied Genetics of Leguminosae Biotechnology. Dordrecht; Boston: Kluwer Academic Publishers; 2003. p.89-120.

21. Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M. Recent advances in legume transformation. Plant Physiology. 2003;131:892-899. DOI: 10.1104/pp.102.017681

22. Ukhatova Y.V., Erastenkova M.V., Korshikova E.S., Krylova E.A., Mikhailova A.S., Semilet T.V., Tikhonova N.G., Shvachko N.A., Khlestkina E.K. Improvement of crops using the CRISPR/Cas System: new target genes. Molecular Biology. 2023;57(3):375-397. DOI: 10.1134/S0026893323030135

23. Xing H.-L., Dong L., Wang Z.-P., Zhang H.-Y., Han C.-Y., Liu B., Wang X.-C., Chen Q.-J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 2014;14:327. DOI: 10.1186/s12870-014-0327-y